mRNA疫苗的生产和监管指导为何如此重要

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我想首先提醒大家一点，这一点在公共讨论中经常被忽略： 新冠mRNA疫苗是真正意义上的新型医疗产品。

在2020年紧急授权之前，mRNA疫苗技术从未大规模应用于人体。此前仅有两项临床试验，分别来自辉瑞-BioNTech和Moderna，对该平台进行了人体测试。在医学史上，总共约有37,000人接种过mRNA疫苗（不包括早期规模小得多的狂犬病、巨细胞病毒和癌症疫苗的早期研究）。这并非批评，而仅仅是陈述事实。但这确实意味着，这些产品的长期安全性过去和现在都尚未被完全了解。

以下内容几乎所有分子生物学家都熟悉。虽然很复杂，但考虑到事关重大，我会尽量简化。清晰地阐述分子框架至关重要，因为这些疫苗的生产方式直接决定了药瓶内的成分。. 注射后，药瓶内的物质会扩散到全身，引发一系列连锁反应，从而导致长期的健康问题。

体外转录不仅仅是生产细节

改良型mRNA疫苗是利用体外转录（IVT）工艺生产的。). IVT 是用于合成修饰后的 mRNA 的方法，该 mRNA 最终成为疫苗中的活性成分。

这并非无关紧要的技术细节。体外质谱法从根本上决定了最终产品的分子组成。

BioNTech公司的科学家们，包括直接参与辉瑞疫苗研发的科学家们，发表了一篇详细的综述。1 本文描述了体外转录（IVT）反应如何生成目标全长mRNA以及一系列副产物和杂质，并阐述了这些副产物和杂质通常如何被去除，以及如果它们持续存在可能产生的生物学后果。Moderna公司在其专利（US10,653,712 B2和US10,077,439 B2）中也详细描述了这些生产流程及其产生的副产物。但更重要的是，这种分子生物学原理早在新冠疫情爆发之前就已经得到充分研究。以上内容并非推测。

起始材料：DNA模板

从本质上讲，体外转录反应始于编码目标蛋白的双链DNA。在本例中，目标蛋白是SARS-CoV-2的刺突蛋白。

mRNA疫苗中使用的刺突蛋白编码序列是 转基因 为了提高稳定性和细胞耐受性，我们进行了两项氨基酸替换，使其与病毒刺突蛋白有所区别。这项修饰是：故意.

DNA模板本身可以呈现不同的形式。在辉瑞早期的临床试验中，使用的是PCR扩增产生的DNA片段。然而，商业化生产过程则依赖于源自质粒的DNA。这一点至关重要，因为质粒含有额外的调控序列。就辉瑞而言，这些序列包括SV40启动子和ori序列等元件，如果它们进入人体细胞，则会引发人们的担忧。

一旦将此 DNA 模板添加到 IVT 反应中，与 RNA 聚合酶和其他成分一起，它就会被转录成 mRNA（图 1）。

虽然体外转录的预期产物是全长mRNA，但实际产物更为复杂。这些产物包括各种副产物，例如：（1）各种RNA种类，包括双链RNA（dsRNA）；（2）与RNA结合的DNA（RNA-DNA杂交体）；以及（3）来自原始模板的游离DNA（图2）。

这些副产物的形成是有据可查且不可避免的，因此下游纯化对于安全而言绝对至关重要。

提纯技术存在已知局限性

生产完成后，需要两个纯化步骤，首先去除DNA，然后去除RNA副产物（图3）：

为了去除DNA，需要在反应混合物中加入一种名为DNase I的酶，它常用于降解污染的DNA。虽然DNase I对游离的模板DNA有效，但包括BioNTech科学家自身研究在内的多项研究表明，DNase I去除与RNA结合的DNA（RNA-DNA杂交体）的效率很低。

这一局限性并无争议，文献中已有记载。

独立分析表明

了解这一背景对于解读近期对成品疫苗瓶进行的独立分析至关重要。

研究人员3 和监管机构4 据报道，几乎每个受检样品瓶中都检测到了DNA污染物。这些污染物包括双链DNA和RNA-DNA杂交体，它们似乎对DNase I消化具有抗性。

在某些样本中，刺突蛋白编码DNA的含量比其他质粒序列高出100倍以上。5这表明消化不均匀或不完全。测序和定量PCR分析进一步检测到平均长度约为200个碱基对的DNA片段，部分片段长度超过4千碱基对。在一些情况下，观察到了几乎覆盖整个质粒的序列。

综上所述，这些发现引发了人们对大规模生产过程中纯化的一致性和完整性的严重质疑，以及对人体内残留核酸可能造成的生物学后果的质疑。

为什么核酸污染物对生物学很重要

RNA和DNA是先天免疫通路的重要激活剂。这并非推测。模式识别受体和cGAS-STING通路对外来核酸反应强烈，可引发炎症、生长抑制甚至细胞死亡。

正是由于这些机制，基因治疗产品才需要受到严格的安全监管。

具有讽刺意味的是，新冠病毒mRNA疫苗的设计初衷就是通过改造来降低这种强烈的先天免疫激活。但即便经过这些改造，RNA-DNA杂交体和DNA片段仍然会引发强烈的免疫反应。

坚持不懈引发新问题

现在有大量证据表明，接种疫苗后，刺突蛋白 mRNA 和蛋白质会在人体组织中持续存在数周、数月甚至数年（表 1）。

我们尚不清楚这种持久性反映的是mRNA的长期稳定性、持续翻译还是基于DNA的机制。但考虑到DNA整合的可能性，以及肌肉细胞中长期存在的未整合质粒DNA，6 可以合理推断，接种疫苗数年后刺突蛋白 mRNA、蛋白质和抗体的持续存在与 IVT 后的 DNA 杂质和副产物有关。

短期和长期安全影响

综合来看，这些数据引发了几个重要的安全问题。

首先，已有报道称，接种疫苗后立即出现急性免疫反应，包括细胞因子风暴和过敏反应。鉴于我们对核酸诱导免疫激活的了解，不应轻易将如此强烈的炎症反应与杂质无关。

其次，也是更为关键的，是长期风险。持续的刺突蛋白表达可能导致慢性免疫综合征。更令人担忧的是DNA整合的可能性，这会带来插入突变或基因破坏的风险。这意味着，根据DNA整合的位置和年龄，可能会出现癌症或发育缺陷的风险。

值得注意的是，美国食品药品监督管理局（FDA）在其信息表中明确指出，这些疫苗尚未出现任何问题。已对致癌性（癌症形成）或基因毒性（DNA损伤）进行评估，这一点在基因治疗监管中是常规且预期的，因为长期监测是标准做法。

mRNA疫苗中DNA监管的空白

既然mRNA疫苗中存在残留DNA已毋庸置疑，那么问题就变成了：现行的指导原则和安全限值是否适用于mRNA疫苗？我们已得到保证，DNA副产物的含量在监管指南规定的限值范围内。那么，FDA对DNA副产物和污染物有何指导意见？

FDA关于残留DNA（每剂≤10 ng）的最常被引用的指导原则是针对在活细胞中生产的病毒疫苗制定的，这些病毒疫苗的DNA片段化且“裸露”，进入人体细胞的能力有限。然而，mRNA疫苗并非在细胞中生产，其残留DNA并非来源于宿主细胞，更重要的是，mRNA疫苗中的DNA并非裸露的。它与脂质纳米颗粒（LNP）递送系统结合，而LNP递送系统能够使DNA非常容易地进入细胞。FDA在2010年发布的指导原则明确指出，它并未针对与LNP产品相关的DNA设定相关的安全阈值。

另一项常被引用的指南来自世界卫生组织，针对的是重组蛋白疗法，例如单克隆抗体或工程细胞生产的激素等产品中残留的DNA。同样，这里的残留DNA来源于宿主细胞或表达质粒，以痕量、非包封DNA（裸露DNA）的形式存在，最终产品是纯化蛋白，而非核酸疗法（mRNA疫苗）。因此，该指南不适用于mRNA疫苗。

FDA和WHO关于残留DNA的监管标准最常被引用，但这些标准均不符合要求。这些技术是为mRNA疫苗开发的，并没有直接解决这一安全问题。

世界卫生组织对mRNA疫苗的看法——部署之后

2022年，世界卫生组织发布了专门针对mRNA疫苗的指导意见。7值得注意的是，这份文件已发布。后这些产品在全球范围内的推广。该指南明确指出，此举是为了应对以下情况：“与这项新技术相关的安全、生产和监管问题。该文件还作出了以下几项重要陈述：

“由于目前尚无关于生产方法的详细信息，安全有效的mRNA疫苗的控制措施也尚未标准化，而且某些细节仍属于专有信息，因此无法公开获取，所以目前制定具体的国际指南或建议是不切实际的。=

报告还指出：“详细的生产和控制程序……应与国家监管局（NRA）讨论并获得其批准。] 根据具体情况而定。=

世界卫生组织承认，mRNA疫苗的控制措施尚未标准化，制定具体的国际指南或建议也不切实际。此外，还需要各国主管部门进行个案评估，并接受监管监督。

这是在mRNA疫苗投入使用后发表的声明。.

截至撰写本文时，FDA 仍未制定 mRNA 疫苗的标准化指南，也没有提供任何证据和基于安全性的数据来支持 mRNA 疫苗中 DNA 的任何限制。

最后，值得重申的是：虽然mRNA技术并非新生事物，但在新冠疫情之前，它一直被归类为基因疗法，而非传统疫苗。新冠疫苗中DNA副产物的安全问题，同样适用于所有mRNA疫苗，包括流感疫苗、呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗，甚至癌症mRNA疫苗。

这是因为mRNA产品本质上不同。它们必须进入细胞并指导细胞产生外源蛋白。这与其他直接递送蛋白的传统疫苗截然不同。目前尚无该平台的临床先例，也无重复给药的临床先例，更不用说大规模人群应用了。

现阶段，在没有疫情的情况下，随着机制数据和临床观察的积累，以及mRNA疫苗产品大量涌入市场，我们需要监管机构，特别是FDA，在制定这些产品生产的关键指导方针方面，保持透明度并直接参与严肃的安全研究——尤其是在与DNA副产品相关的方面。

新技术需要新的审视——而不是沉默、精神操控或审查。

案例

1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full

2 Webb C、Ip S 等，《分子药理学》2022 年 4 月 4 日；19(4):1047-1058。doi：10.1021/

3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed

4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.

5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf

6 Wang等人（2004）——“肌内注射和电穿孔后质粒DNA整合到宿主基因组DNA中的检测”（《基因治疗》，2004）。在小鼠中，将裸露的质粒DNA肌内注射，随后进行电穿孔以增强其吸收。作者使用高灵敏度PCR对纯化的基因组DNA（通过凝胶分离去除染色体外形式）进行检测，在注射后4周鉴定出4个独立的整合事件。连接测序证实整合位点随机（无优先热点），与非同源末端连接一致。整合频率较低但可测量。这是迄今为止最清晰地证明裸露质粒DNA在肌肉中自发整合事件发生的研究之一。值得注意的是，该研究采用电穿孔增强DNA递送，这可以与脂质纳米颗粒（LNP）增强递送进行比较。

Martin等人（1999）——“质粒DNA疟疾疫苗：肌内注射后基因组整合的可能性”（《人类基因治疗》）。这项早期研究在小鼠体内测试了质粒DNA肌内注射，并使用Southern印迹杂交和PCR技术检测高分子量基因组DNA的整合情况。虽然质粒DNA主要存在于染色体外，但他们报告了一些样本中存在罕见整合的证据（尽管其测序结果不如后来的研究那样明确）。该研究为低风险设定了基准，但也承认存在极低频率整合事件的可能性，这影响了美国食品药品监督管理局（FDA）随后发布的DNA疫苗指南。

Ledwith等人（2000）——“质粒DNA疫苗：小鼠肌肉注射后整合到宿主细胞DNA的研究”（病毒学杂志）。将裸露的质粒DNA肌肉注射到小鼠体内，虽然未观察到可检测的整合，但在长达26周的时间内，仍可在股四头肌中检测到DNA。该DNA位于染色体外。

7 世界卫生组织生物制品标准化专家委员会第74次报告附件3：信使RNA疫苗预防传染病的质量、安全性和有效性评价：监管方面的考虑 https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf

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